導讀：在*范圍(wei)內，肺(fei)癌(ai)是(shi)威脅(xie)公眾健康的*惡性(xing)腫瘤(liu)，早(zao)期診(zhen)斷(duan)可大大提(ti)高(gao)5年(nian)存活率。肺(fei)泡灌(guan)洗(xi)液（BALF）由于(yu)創傷(shang)小、毗鄰腫瘤(liu)細胞，有(you)望成為肺(fei)癌(ai)的早(zao)期診(zhen)斷(duan)標(biao)本(ben)。然而，受諸多(duo)因(yin)素影(ying)響，BALF的細胞學(xue)檢(jian)(jian)查靈(ling)敏(min)度并不(bu)高(gao)。近年(nian)來，隨著分子遺(yi)傳(chuan)學(xue)技術(shu)的發展，靈(ling)敏(min)度高(gao)、特異性(xing)強的腫瘤(liu)標(biao)志基因(yin)檢(jian)(jian)測(ce)被廣泛地應用于(yu)臨床診(zhen)斷(duan)、治療及預后(hou)評估。BALF遺(yi)傳(chuan)學(xue)標(biao)志物的檢(jian)(jian)測(ce)有(you)望輔助肺(fei)癌(ai)早(zao)期診(zhen)斷(duan)。
1、肺癌與DNA甲基化(hua)
DNA甲基(ji)化是(shi)(shi)表型(xing)修飾的一(yi)種(zhong)，與(yu)癌(ai)癥(zheng)的發生密切相關。尤其是(shi)(shi)CpG島(dao)區的啟動子超(chao)甲基(ji)化可能會導致(zhi)抑(yi)癌(ai)基(ji)因(yin)轉錄沉默(mo)，從而影(ying)響腫瘤(liu)發生的進程。由(you)于DNA甲基(ji)化幾乎在(zai)所有癌(ai)癥(zheng)中均有發現，并(bing)且發生在(zai)癌(ai)前(qian)或者(zhe)癌(ai)癥(zheng)早期(qi)階段，因(yin)而有望成為癌(ai)癥(zheng)早期(qi)診斷的理想標志(zhi)物。矮小同源盒基(ji)因(yin)（SHOX2）和RAS相關家族1A(RASSF1A)是(shi)(shi)常見(jian)的肺癌(ai)DNA甲基(ji)化標志(zhi)物。
SHOX2屬SHOX基因(yin)家族，位于3號染色(se)體q25-q26.1區域，編碼60個氨基酸(suan)構成的(de)(de)(de)DNA結合區域蛋白(bai),是(shi)一種(zhong)常見的(de)(de)(de)轉錄(lu)調控(kong)因(yin)子。RASSF1A是(shi)Ras信號通(tong)路的(de)(de)(de)成員，位于3號染色(se)體p21.3，調控(kong)細(xi)(xi)胞的(de)(de)(de)增殖和(he)自噬。研(yan)究顯示，相比于肺腺癌(ai)，SHOX2基因(yin)甲基化檢測對于小(xiao)細(xi)(xi)胞肺癌(ai)和(he)鱗癌(ai)具(ju)有更高的(de)(de)(de)特異性。而(er)RASSF1A的(de)(de)(de)表達下調對肺腺癌(ai)的(de)(de)(de)發(fa)展至關重要。
2、DNA甲基化檢(jian)測方法(fa)
對于特(te)定(ding)片(pian)段的甲基化檢測方法很多(duo)，包(bao)括(kuo)甲基化特(te)異性(xing)(xing)(xing)PCR（MS-PCR）、亞硫酸鹽(yan)處(chu)理+測序、聯合(he)亞硫酸鹽(yan)的限制性(xing)(xing)(xing)內切酶法（COBRA）、焦(jiao)磷酸測序、PCR熒光變性(xing)(xing)(xing)曲線分析及熒光定(ding)量法（MethyLight）等。
MS-PCR：DNA 經(jing)亞硫酸鹽處(chu)理(li)后, 非(fei)甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)化的(de)(de)(de)胞(bao)(bao)嘧(mi)啶(ding)轉變為尿嘧(mi)啶(ding), 而甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)化的(de)(de)(de)胞(bao)(bao)嘧(mi)啶(ding)保持不變。在(zai)PCR 反應(ying)時(shi), 有兩套不同的(de)(de)(de)引物對，分別針對經(jing)處(chu)理(li)后的(de)(de)(de)甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)化和非(fei)甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)化鏈，若甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)化的(de)(de)(de)鏈被(bei)擴增(zeng)出(chu)說(shuo)明發檢測位點生了甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)化，若非(fei)甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)化的(de)(de)(de)鏈被(bei)擴增(zeng)出(chu)，則說(shuo)明無甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)化。
亞硝(xiao)酸鹽測(ce)(ce)序：DNA 經亞硫(liu)酸鹽處(chu)理(li)后(hou)(hou)，PCR擴增待測(ce)(ce)片段，隨(sui)后(hou)(hou)對(dui)產物(wu)進(jin)行測(ce)(ce)序，并于未(wei)經處(chu)理(li)的序列進(jin)行比(bi)對(dui)，判斷是否發生甲基化。
COBRA：DNA經亞硫(liu)酸鹽處理(li)后, 對待測(ce)片段進(jin)行(xing)(xing)PCR擴增，并用(yong)限制性內切(qie)酶進(jin)行(xing)(xing)切(qie)割, *甲(jia)基化(hua)的(de)片段可(ke)被(bei)識別(bie)切(qie)割，非甲(jia)基化(hua)的(de)則不能被(bei)識別(bie)切(qie)割。對酶切(qie)產物進(jin)行(xing)(xing)電泳分(fen)析(xi), 根據條帶(dai)判斷(duan)樣本中甲(jia)基化(hua)程度。
焦磷酸法測序：通過酶級聯反應每個dNTP的(de)聚合與熒光(guang)信(xin)號(hao)的(de)釋放(fang)偶(ou)聯，通過檢測熒光(guang)的(de)釋放(fang)和(he)強度，可實現DNA測序的(de)目的(de)。
PCR熒光(guang)變性(xing)曲(qu)線分析：DNA經亞硫酸鹽處理后, 對待(dai)檢DNA 片段進行PCR 擴增，檢測DNA 結(jie)合(he)染料的熒光(guang)強度，獲得待(dai)檢DNA 的熔解曲(qu)線。通過變性(xing)溫度的不同(tong)即可區(qu)分甲(jia)(jia)基化與非甲(jia)(jia)基化的DNA。
MethyLight：此(ci)法結(jie)合(he)了亞(ya)硫(liu)酸鹽(yan)修飾(shi)與Taqman探(tan)針技術。DNA 經亞(ya)硫(liu)酸鹽(yan)處理后(hou), 非(fei)甲(jia)基化的C被(bei)(bei)(bei)修飾(shi)成U（擴(kuo)增時被(bei)(bei)(bei)T取(qu)代），而甲(jia)基化C保持不變。隨后(hou)的RT-PCR擴(kuo)增過(guo)程中，對于甲(jia)基化的樣本，探(tan)針可與待檢位點雜交, PCR 延伸時，報告熒光基團(tuan)會被(bei)(bei)(bei)Taq酶切下(xia)釋放光信號(hao), 而非(fei)甲(jia)基化樣本則不能被(bei)(bei)(bei)引物結(jie)合(he)擴(kuo)增，通過(guo)檢測熒光信號(hao)的強弱即可判斷DNA 的甲(jia)基化狀態。
張(zhang)毅(yi)敏(min)等(deng)、Ren等(deng)及(ji)Zhang等(deng)基(ji)于(yu)此法(fa)(fa)(fa)對(dui)臨床上疑似肺(fei)癌患者的(de)(de)(de)SHOX2和(he)RASSF1A 基(ji)因進行了(le)甲基(ji)化檢(jian)測(ce)，并與測(ce)序法(fa)(fa)(fa)進行了(le)比對(dui)。在張(zhang)毅(yi)敏(min)等(deng)的(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)中，兩種方法(fa)(fa)(fa)對(dui)SHOX2和(he)RASSF1A 基(ji)因甲基(ji)化檢(jian)測(ce)的(de)(de)(de)一(yi)致率(lv)(lv)分(fen)別為97.5%和(he)98.0%。Ren等(deng)的(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)中，一(yi)致率(lv)(lv)則分(fen)別達到了(le)99%和(he)100%。Zhang等(deng)的(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)中也表(biao)現出了(le)*的(de)(de)(de)一(yi)致性。說明了(le)此法(fa)(fa)(fa)用于(yu)甲基(ji)化檢(jian)測(ce)的(de)(de)(de)可靠性。與測(ce)序法(fa)(fa)(fa)相比，該法(fa)(fa)(fa)操作簡單(dan)、成(cheng)本低，且所需DNA樣(yang)本量很少(shao)，減少(shao)了(le)樣(yang)本搜集難度，故(gu)有望取代前者的(de)(de)(de)甲基(ji)化檢(jian)測(ce)。
3、DNA甲基(ji)化檢測助力肺癌臨床診斷(duan)
3.1 大(da)大(da)高于傳統(tong)指標的靈敏(min)度(du)和特異性
張毅敏(min)等(deng)(deng)的(de)研(yan)究(jiu)結(jie)果顯示，SHOX2和(he)(he)(he)RASSF1A任意甲基化(hua)陽性對(dui)肺癌的(de)敏(min)感性和(he)(he)(he)特異性分(fen)(fen)別(bie)(bie)為74.3%和(he)(he)(he)87.1%。Ren等(deng)(deng)的(de)研(yan)究(jiu)結(jie)果與此十分(fen)(fen)接(jie)近，分(fen)(fen)別(bie)(bie)為71.5%和(he)(he)(he)90%。而Zhang等(deng)(deng)則(ze)分(fen)(fen)別(bie)(bie)達到81.0%和(he)(he)(he)97.4%。Zhang等(deng)(deng)還對(dui)細胞學和(he)(he)(he)血清CEA對(dui)肺癌的(de)靈(ling)敏(min)度進行了(le)統計，分(fen)(fen)別(bie)(bie)為68.3%和(he)(he)(he)30.6%。
3.2 區(qu)分其他惡性腫瘤(liu)和良性疾病
三(san)項(xiang)研究(jiu)中(zhong)均(jun)(jun)用其(qi)他惡(e)性(xing)腫(zhong)瘤和良(liang)性(xing)疾病做(zuo)了(le)對照，甲(jia)基化陽性(xing)率均(jun)(jun)遠遠低于肺癌，因而提示SHOX2/RASSF1A甲(jia)基化檢測有望用于區分肺癌和其(qi)他惡(e)性(xing)腫(zhong)瘤和良(liang)性(xing)疾病，具體數據見表1：
SHOX2/RASSF1A基(ji)因(yin)甲(jia)基(ji)化任意陽性率
張(zhang)毅敏(min) Ren Zhang
肺癌(ai) 74.3% 71.5% 81.6%
良性肺病/其他惡性腫瘤 12.9% 10.0% 2.6%
3.3 重要的早(zao)期診(zhen)斷價值
Zhang等(deng)的研(yan)究(jiu)表明，BALF的SHOX2/RASSF1A甲基(ji)化(hua)檢(jian)(jian)測對I期(qi)的肺癌(ai)患(huan)者有(you)(you)*的檢(jian)(jian)出(chu)率，為85.7%，遠高(gao)于(yu)血清CEA和細胞(bao)學的10.7%和46.4%。Ren等(deng)的研(yan)究(jiu)中SHOX2/RASSF1A甲基(ji)化(hua)對肺癌(ai)I期(qi)檢(jian)(jian)出(chu)率則(ze)為70.2%。因(yin)此，SHOX2/RASSF1A甲基(ji)化(hua)對于(yu)肺癌(ai)的早期(qi)診斷具有(you)(you)重要(yao)意義(yi)。
4、透(tou)景肺癌DNA甲基(ji)化檢測(ce)試劑盒重磅(bang)上市
本文提(ti)及的幾篇研(yan)究采用的都是透景生命(ming)開(kai)發的*產品(pin)——人SHOX2、RASSF1A基因甲基化DNA檢(jian)測試劑盒（證(zheng) 2015 1 0203539.1），產品(pin)注(zhu)冊(ce)證(zheng)號(hao)：國械(xie)20173403354，現(xian)已全(quan)面上市！此外，公司正在報批(pi)的同類(lei)產品(pin)還有結(jie)直腸癌Septin9甲基化檢(jian)測試劑盒，敬請期(qi)待！
參考文獻
張毅敏, *麗, 吳(wu)杰,等. 肺泡灌洗液中SHOX2和RASSF1A基(ji)(ji)因甲基(ji)(ji)化聯合檢測對肺癌的診(zhen)斷價值[J]. 腫瘤學雜志, 2016, 22(12):1032-1036.
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